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简介:

双向电泳(two-dimensional electrophoresis)是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合,即先进行等电聚焦电泳(按照pI分离),然后再进行SDS-PAGE(按照分子大小),经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

操作流程:

第一向等电聚焦

⒈从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含IPG buffer)一小管(1ml/管),置室温溶解。

⒉在小管中加入0.01g DTT, 0.5% 对应胶条pH范围的IPG buffer,充分混匀。

⒊从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品(考马斯亮蓝染色需样品1mg,银染需300μg),充分混匀。

⒋从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条,室温中放置10分钟。

⒌沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯。注意:不要产生气泡。否则影响到胶条中蛋白质的分布。

⒍当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。

⒎分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收。同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡。如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外。

⒏在每根胶条上覆盖1-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上。

⒐对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序。

⒑聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。

第二向SDS-PAGE电泳

⒈装配灌胶模具,配制10%的丙烯酰胺凝胶两块。配200ml凝胶溶液,每块凝胶50ml,将溶液沿灌胶模具背面槽道倒入,直至溶液到距离玻璃板1cm停止,用75%乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整。聚合30分钟后,凝胶与上方液体分层,表明凝胶已基本聚合,建议聚合3-5h使凝胶完全聚合。

⒉待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗。

⒊从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其恢复至室温。

⒋配制胶条平衡缓冲液I(含DTT)。

5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

⒍将胶条转移至平衡管或溶胀盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5-10ml胶条平衡缓冲液I。将平衡管或溶胀盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒎配制胶条平衡缓冲液Ⅱ(含碘乙酰胺)。

⒏第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。再加入胶条平衡缓冲液Ⅱ,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟。

⒐用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶部对着自己。

⒑将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解。

⒒将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液。赶去缓冲液表面的气泡。

⒓第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液Ⅱ。并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面)。

⒔将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中。然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。其余胶条同样操作。

⒕将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己。在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液。

⒖用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。注意不要在胶条下方产生任何气泡。在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面。

⒗放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固。

⒘在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后。将凝胶转移至电泳槽中。

⒙在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低功率(1W/gel/18-24cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(13-15W/gel/18-24cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

⒚电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号。

⒛进行染色。

服务要求:

1、样品新鲜。

说明:组织样本及细胞采样后应立即放入液氮中速冻或加入样品稳定剂,运输过程中血液、血清样品4℃保存,其它样品-20℃保存,不超过48小时。

2、样品蛋白的总量不少于1mg。
  说明:组织样本每份约250-500mg; 细胞样品每份106—107细胞数(一块胶);血液、血清等样品大于5mL,且不能溶血;蛋白提取物要求蛋白浓度大于5mg/mL,总量不少于1mg,且均匀无沉淀,样品中无盐成分;植物或真菌样品量湿重不少于2g;富含杂质或蛋白质含量低的样品量湿重不少于3g。

 

结果提供:

详细的实验步骤、凝胶扫描图片及相关数据分析。

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