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简介:
一、普通PCR,是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR),将DNA双链在高温下打开(变性),再以每条单链为模板复制出互补链,如此循环,使基因大量扩增,通常用来构建载体、鉴定是否转基因产品或者基因的生物信息学分析等等。
基本原理:
类似于DNA的 天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:
1.模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
2.模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
3.引物的延伸:DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的"半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

二、逆转录PCR(reverse transcription PCR)或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被逆转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。主要用于mRNA的检测,可以做定性和半定量检测。一般用于检测细胞中基因表达水平、表达差异,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。RT-PCR比其他包括Northern印记、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术,更灵敏,更易于操作。
操作流程:
1、取0.5 ml PCR管,依次加入下列试剂:第一链cDNA   2 μl;上游引物(10 pM)2 μl;下游引物(10 pM)2 μl;dNTP(2 mM) 4 μl;10×PCR buffer 5 μl;Taq 酶(2 u/μl)1 μl; 
 2、加入适量的ddH2O,使总体积达50 μl。轻轻混匀,离心; 
 3、设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对内参(如G3PD)的特异性引物,同时扩增内参DNA,作为对照; 
 4、电泳鉴定:行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果; 
 5、密度扫描、结果分析:采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。

服务要求:
1、客户需提供新鲜的且尽量多的材料,或直接提供纯化好的总RNA或DNA(大于5ug/样本),如是组织:100-200mg。
2、客户提供目的基因的详细资料。

结果提供:
详细的实验步骤、琼脂糖凝胶电泳图及相关数据。

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