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简介:

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。

 

操作流程:

(1) 用生物信息学方法分析并预测启动子区可能的转录因子结合位点。

(2)设计引物用PCR法从基因组DNA中克隆所需的靶启动子片段,将此片段插入到荧光素酶报告基因质粒(pGL3-basic)中。

(3)筛选阳性克隆,测序。扩增克隆并提纯质粒备用。

(4) 扩增转录因子质粒,提纯备用。同时准备相应的空载质粒对照,提纯备用。

(5) 培养293(或其它目的细胞),并接种于24孔板中,生长10-24小时(80%汇合度)。

(6) 将报告基因质粒与转录因子表达质粒共转染细胞。

(7)提取蛋白并用于荧光素酶检测。

(8) 加入底物,测定荧光素酶的活性。

(9) 计算相对荧光强度,并与空载对照比较。

 

服务要求:

1、客户提供含有目的基因的pGL与pRL系列质粒(分别含有萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶报告基因)或其它相关质粒(要求可以直接用于转染,浓度≥0.5μg/μl,提供10μg)

2、客户提供细胞(≥3×106,可传代,倍增时间小于48小时)以供转染。

结果提供:

详细的实验步骤、原始数据和图片、结果分析。

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