服务电话:0571-86871128赛澜生物技术(杭州)有限公司欢迎您!
您所在的位置:首页 » 产品与服务 » 核酸研究 » 荧光定量PCR

 

 

 

简介:

荧光定量PCR(也称TaqMan PCR,以下简称FQ-PCR)是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术,该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针,通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板量定量及定性的分析。

 

荧光定量PCR分类:

  1. Taqman荧光探针

PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记了一个报告荧光基因和一个猝灭荧光基因。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和猝灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

 

  1. SYBR Green荧光染料

SYBR Green是一种DNA结合染料,能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下,它不发出荧光,但一旦结合到双链DNA中以后,便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合,用于任意反应体系中。从经济角度考虑,它也比其他探针的价格要便宜很多。但由于它能与所有的双链DNA结合,所以一旦反应体系中出现非特异性扩增,那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素,可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。

 

操作流程:

  1. 设计并合成引物;
  2. 引物预实验,摸索合适的PCR反应条件;
  3. 客户样品RNA抽提

实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提剂Trizol(Invitrogen),研磨后抽提RNA;

实验对象为细胞样品,每份样品取1x106~1x107细胞,PBS清洗细胞,去PBS加1ml的RNA抽提剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA;

  1. RNA质量检测;

紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度;使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。

  1. 反转录;
  2. 制备标准曲线样品:进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增,其产物进行梯度稀释用于做标准曲线;
  3. 标准曲线样品和待测样品分别进行RealTime PCR扩增和检测;
  4. 检测结果进行标准曲线分析:以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。

 

服务要求:

1、客户需提供新鲜的且尽量多的材料,或直接提供纯化好的总RNA或DNA(大于5ug/样本),如是组织:100-200mg。

2、客户提供目的基因的详细资料。

 

结果提供:

详细的实验步骤及相关数据、标准曲线、扩增曲线、溶解曲线。

  • 点击这里给我发消息
  • 点击这里给我发消息
  • 点击这里给我发消息
友情链接
Copyright © 2003-2015 68design.net, All Rights Reserved地址:杭州市滨江区滨安路688号天和高科技产业园G幢5层 赛澜生物技术(杭州)有限公司