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简介:

细胞在发生凋亡时,会激活一些DNA内切酶,这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测,可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin-dUTP),随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合,最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞,从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。

操作流程:

1、脱蜡:用二甲苯浸洗5 min×2次;

2、水化:用梯度乙醇(100%×5 min、100%×3 min、95%×3 min、85%×3 min、70%×3 min、50%×3 min);

3、浸洗:0.85%NaCl×5 min→PBS洗5 min;

4、固定:浸入4%多聚甲醛15 min;

5、浸洗:PBS 5 min×2次;

6、细胞通透:用每片100 ul 20 μg/ml Proteinase K处理组织15(10~30) min RT;

7、浸洗:PBS洗5 min;

8、固定: 浸入4%多聚甲醛5 min;

9、、浸洗:PBS 5 min×2次;

10、平衡:加100 ul平衡液,湿盒平衡10(5~10) min;

11、制备TUNEL反应混合液:处理组用1 μl rTdT+1 μl 生物素标记的dUTP+98 ul平衡液混匀;而阴性对照组不加rTdT,改为三蒸水;阳性对照组先加入100 μl DNase 1 缓冲液孵育5 min,甩掉液体后再加100 ul DNase 1(10 U/ml)酶切10 min,用去离子水冲洗4次,PBS浸洗5 min,后面步骤从第10步开始。

12、标记反应:加100 μl TUNEL反应混合液于标本上,加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×1 h。

13、终止反应:浸入2×SSC 15 min;

14、浸洗:PBS 5 min×3次;

15、封闭POD:浸入0.3%H2O2 15 min;

16、浸洗:PBS 5 min×3次;

17、酶标反应:加100 ul streptavidin标记HRP(按1:500 PBS稀释)30 min;

18、浸洗:PBS 5 min×3次;

19、DAB显色(避光):加100 ulDAB混合液(50 ulDAB+50 ulDAB底物缓冲液+50 ul H2O220×+950 ul三蒸水)10 min左右,镜下出现浅棕色背景时。

20、用去离子水冲洗几次;

21、用苏木素复染,3 s左右后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水(50、70、85、95、100、100%各1 min)、二甲苯透明1 min×2次、中性树胶封片。

22、加一滴PBS或甘油在视野下,用光学显微镜观察凋亡细胞(共计200~500个细胞)并拍照。可结合凋亡细胞形态特征来综合判断(未染色细胞变小,胞膜完整但出现发泡现象,晚期出现凋亡小体,贴壁细胞出现邹缩、变圆、脱落;而染色细胞呈现染色质浓缩、边缘化,核膜裂解,染色质分割成块状/凋亡小体)。

 

服务要求:

1.客户需提供石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片,及目的蛋白一抗。
2.组织切片厚度小于50um。
3.用于石蜡包埋的组织,活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定,避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。
4.用于冰冻切片的组织,取材后应立即放如液氮冷冻,然后放入-80℃保存。
5.取材时应保持所检标本原有的结构、形态,为避免挤压组织,尽量使用锋利刀片,并且避开坏死组织,除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。

 

结果提供

详细的实验步骤、原始图片、结果分析。

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