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简介:

免疫组化是应用免疫学基本原理-抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原

(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。免疫组织化学技术按照标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。

 

操作流程:

1烤片:37℃烘烤30min以上;

2脱蜡:依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min;

3抗原修复:脱蜡后在PBS中洗三遍,每次5min,再加入3%H2O2浸泡10min,以除去内源性的过氧化氢酶;PBS中洗三遍,每次5min;再加入柠檬酸缓冲液,微波修复,使抗原的位点暴露出来;

4血清封闭:冷却至室温后,PBS中洗三遍,每次5min;加上血清,37℃孵育30min,来封闭非特异性的位点;

5加一抗:将温箱中的玻片取出,用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清,加一抗,对照实验组织加PBS,4℃孵育过夜;

6加二抗:将玻片取出,室温复温30min;PBS中洗三遍,每次5min;擦干组织周围的PBS后加上二抗,37℃孵育30min;

免疫荧光实验在此步后DAPI染核:PBS洗三遍,每次5min;加入DAPI,室温孵育10-15min;PBS洗三遍,每次5min;荧光显微镜观察。

7加SABC:PBS洗三遍,每次5min;擦干组织周围的PBS后加上SABC,37℃孵育30min;

8显色:PBS洗三遍,每次5min;擦干组织周围的PBS后加上DAB显色剂,显微镜下观察着色情况,及时终止;

9复染:显色后PBS冲洗一段时间后,浸泡于苏木精中染色,一般动物组织为30s,植物组织3-5min;

10脱水:将复染后的片子置于水中清洗后,依稀将玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,移至通风橱;

11封片:在通风橱中用中性树胶滴在组织旁边,再用盖玻片盖上,要先放平一侧,然后轻轻放下另一侧,以免产生气泡,封号片子后置于通风柜中晾干。

12阅片:显微镜下观察,根据阳性染色面积和深浅确定目的蛋白表达的强弱。

 

服务要求:

1.客户需提供石蜡切片/冰冻切片/细胞爬片,及目的蛋白一抗。
2.组织切片厚度小于50um。
3.用于石蜡包埋的组织,活检或手术切除标本应在2小时内取材或固定,避免组织自溶及抗原变性等影响免疫组化结果。
4.取材时应保持所检标本原有的结构、形态,为避免挤压组织,尽量使用锋利刀片,并且避开坏死组织,除取病灶或含待检抗原部位外,还应取病灶与正常交界处,即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区,以形成自身对照。

 

结果提供:

详细的实验步骤、原始图片、结果分析。

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