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简介:

原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。其基本原理是:在细胞或组织结构保持不变的条件下,用标记的已知的RNA核苷酸片段,按核酸杂交中碱基配对原则,与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交),所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术 经不断改进,其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析,已 成为最有效的分子病理学技术,同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的重要方向。

FISH是原位杂交技术大家族中的一员,因其所用探针被荧光物质标记(间接或直接)而得名。基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火 温度下复性;通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象(即维持其原位)的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平 的分析。荧光标记探针不对环境构成污染,灵敏度能得到保障,可进行多色观察分析,因而可同时使用多个探针,缩短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。

操作流程:

1、探针及标本的变性 
(1)探针变性:将探针在75℃怛温水浴中温育5min,立即置0℃,5~10min,使双链DNA探针变性。

(2)标本变性:

①将制备好的染色体玻片标本于50℃培养箱中烤片2~3h。(经Giemsa染色的标本需预先在固定液中退色后再烤片)。

②取出玻片标本,将其浸在70~75℃的体积分数70%甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2~3min。
③立即按顺序将标本经体积分数70%、体积分数90%和体积分数100%冰乙醇系列脱水,每次5min,然后空气干燥。
2、杂交
    将已变性或预退火的DNA探针10mL滴于已变性并脱水的玻片标本上,盖上18×18盖玻片,用Parafilm封片,置于源潮湿暗盒中37℃要交过夜(约15~17h)。由于杂交液较少,而且杂交温度较高,持续时间又长,因此为了保持标本的湿润状态,此过程在湿盒中进行。
3、洗脱
(1)杂交次日,将标本从37℃温箱中取出,用刀片轻轻将盖玻片揭掉。
(2)将已杂交的玻片标本放置于已预热42~50℃的体积分数50%甲酰胺/2×SSC中洗涤3次,每次5min。
(3)在已预热42~50℃的1×SSC中洗涤3次,每次5min。
(4)在室温下,将玻片标本2×SSC中轻洗一下。
4、杂交信号的放大 
(1)在玻片的杂交部位加150mL封闭液I,用保鲜膜覆盖,37℃温育20min。
(2)去掉保鲜膜,再加150mL avidin-FITC于标本上,用保鲜膜覆盖,37℃继续温育40min。
(3)取出标本,将其放入已预热42~50℃的洗脱液中洗涤3次,每次5min。
(4)在玻片标本的杂交部位加150mL封闭液II,覆盖保鲜膜,37℃温育20min。
(5)去掉保鲜膜,加150mL antiavidin于标本上,覆盖新的保鲜膜,37℃温育40min。
(6)取出标本,将其放入已预热42~50℃的新洗脱液中,洗涤3次,每次5min。
(7)重复步骤(1)、(2)、(3),再于2×SSC中室温清洗一下。
(8)取出玻片,自然干燥。
(9)取200mL PI/antifade染液滴加在玻片标本上,盖上盖玻片。
5、封片
    可采用不同类型的封片液。如果封片中不含有Mowiol(可使封片液产生自封闭作用),为防止盖片与载片之间的溶液挥发,可使用指甲油将盖片周围封闭。

6、荧光显微镜观察FISH结果
 

服务要求:

1、客户提供样本(样本类型可为羊水、细胞、病理切片、石蜡片)。
2、关于探针定制,客户只需提供所需标记的DNA(浓度在150 ug/ml, 200 ul以上)。

结果提供:

详细的实验步骤、原始图片、结果分析。

 

原位杂交组化是一种应用标记探针与组织细胞中的待测核酸杂交,再应用标记物相关的检测系统,在核酸原有的位置将其显现出来的一种检测技术。原位杂交的本质就是在一定的温度和离子浓度下,使具有特异序列的单链探针通过碱基互补规则与组织细胞内待测的核酸复性。

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