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简介

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关,比如在肿瘤发生时,抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加,CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态,导致抑癌基因表达的下降。

 

操作流程:

1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR,MSP)

亚硫酸氢盐处理基因组DNA,所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段,则说明该位点存在甲基化;反之,说明被检测的位点不存在甲基化。

2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)

用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR,在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶,最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序,可以提高测序成功率,这种方法称为BSP-克隆测序法。

3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting,HRM)

在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物,这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化,用亚硫酸氢盐处理后,未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变,样品中的GC含量发生改变,从而导致熔解温度的变化。

 

4.  联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)

DNA样本经亚硫酸氢盐处理后,利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR扩增后保留为CGCG,BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中,C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstUI识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。

 

5.  荧光定量法(Methylight)

此种方法利用TaqMan® 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段,并设计一个能与待测位点互补的探针,随后开展实时定量PCR。随着目标序列甲基化状态的不同,只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针,或只有VIC标记的亚硫酸氢盐转化的未甲化的DNA特异的TaqMan探针能与目标序列杂交。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号。信号强度与PCR产物的量成正比,据此可计算出样品的甲基化程度。

6.  焦磷酸测序

焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术,能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,为甲基化研究提供了新的途径。通过准确定量单个连续的CpG位点上的甲基化频率,焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中,根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此,不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据,甲基化状态也就以序列形式呈现。

7.  高通量测序

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲,依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时,脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息,从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸,包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶。研究人员使用这些动力学特征,鉴定出基因组样品中的腺嘌呤甲基化,并发现再结合circular consensus sequencing,他们能够在单碱基分辨率上鉴定出表观遗传学修饰(mA、mC和hmC)。

8.  飞行质谱

碱基特异性酶切(MassCLEAVE)实验由亚硫酸氢盐处理待测 DNA 开始。经过亚硫酸氢盐处理,DNA中未甲基化的胞嘧啶 (C) 转变为尿嘧啶(U),由此在DNA模板中产生甲基化特异的序列变化。利用 5’39; 末端带有T7-启动子的引物进行 PCR 扩增,产物经 SAP (虾碱性磷酸酶)处理后用于碱基特异性的酶切反应。酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化,飞行质谱能测出每个片段的分子量,配套软件EpiTYPER则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。

服务要求:

    1、组织样本:-20℃或-80℃低温冰箱中保存,液氮或者干冰运输;市内或短途运输可冰袋运输。若提供的材料为新鲜组织、血液细胞等生物材料,请提供足够提取2ug以上基因DNA的材料量。
    2、DNA样本:体积≥20ul,浓度≥100ng/ul,DNA总量≥2ug,20℃保存,低温冰袋运输。
    3、血液样本:要求保存于抗凝管中或冻存管中,体积大于2ml,请用干冰运送,保证DNA不降解。
    4、样品为石蜡包埋组织切片的,要求提供10张组织切片光片(面积>10mm×10mm,厚度约5-10um)。

 

结果提供:

详细的实验步骤、原始图片和数据、结果分析。

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