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蛋白表达与纯化

简介:

蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。通过这个体系可以实现外源基因在宿主中表达的目的。一般由以下几个部分组成:

宿主:表达蛋白的生物体。可以为细菌、酵母、植物细胞、动物细胞等。由于各种生物的特性不同,适合表达蛋白的种类也不相同。

载体:载体的种类与宿主相匹配。根据宿主不同,分为原核表达载体、酵母表达载体、植物表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫表达载体等。载体中含有外源基因片段。通过载体介导,外源基因可以在宿主中表达。

辅助成分:帮助重组蛋白表达、修饰、提高稳定性和溶解性的辅助片段等。

 

蛋白表达有五大表达系统:

原核表达系统

酵母表达系统

昆虫表达系统

哺乳表达系统

植物表达系统

 

操作流程(原核表达系统及纯化):

1. 目标基因全基因合成:

1)从基因库中搜索目标蛋白的cDNA序列。如果我们的cDNA文库中有这个基因,我们免费提供给客户。

2)根据选用的表达系统对cDNA进行密码子优化,密码子优化。

3)合成设计好的基因序列。

 

2. 目标基因亚克隆:

1)扩增并抽提含有目标基因的载体质粒。

2)将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上。

3)测序验证构建质粒的准确性。

 

3. E. coli表达菌株转化及筛选:

1)扩增并抽提构建好的表达质粒。

2)将表达质粒转化到高效的E.Coli表达菌株中。

3)至少挑选5个阳性克隆于LB培养基中扩增并诱导表达目标蛋白。

4)SDS-PAGE电泳检测培养后中目标蛋白的表达情况,并挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。

 

4. 目标蛋白表达及纯化:

1)摇瓶培养1L重组细菌,诱导表达目标蛋白。

2)通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。

3)利用蛋白酶去除不需要的纯化标签,再纯化获得所需的目标蛋白(可选,构建表达载体时需加入合适的蛋白酶切位点)。

4)通过SDS-PAGE电泳检测每步结果并控制最终产品质量。

5)通过Western-blot验证目标蛋白正确性。

 

服务要求:

客户提供目的蛋白的详细背景资料。

 

结果提供:

详细的实验步骤、原始图片及结果分析、纯化好的目的蛋白1-5mg。

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